保水率(%)=m/ms×100%

体外降解性能：称取一定质量(m0)的支架材料，浸泡于胶原酶含量为12.5 U/mL的PBS(pH=7.4)中，37℃恒温培养箱中消化一段时间。在特定时间点取出样品，去离子水洗3次，真空冷冻干燥后称质量(mt)，支架材料的体外降解率为：

降解率=(m0-mt)/m0×100%

主要观察指标：改性处理胶原蛋白海绵的溶胀率、保水率、机械强度及降解性能。

统计学分析：运用SPSS 19.0统计学软件对实验的结果进行描述性分析与t 检验；P＜ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1胶原蛋白自组装工艺优化

2.1.1胶原溶液初始质量浓度对转化率的影响 胶原溶液初始质量浓度对自组装转化率的影响见图1所示。图1A表明在一定质量浓度范围内(0.5-2 g/L)，随着初始质量浓度的增加，转化率也不断升高，初始质量浓度过高(＞ 3 g/L)转化率呈下降趋势。图1B显示，胶原蛋白自组装的浊度曲线主要分为停滞期、增长期和稳定期3个阶段。在开始

20 min内胶原溶液无明显浊度变化，随后浊度快速增加，形成乳白色凝胶，待形成稳定凝胶后，不再有明显浊度变化。初始质量浓度越大浊度越大，停滞期越短。这可能是因为胶原质量浓度越大单位体积内胶原分子越多，分子间相互作用形成的微纤维越多，微纤维之间通过横向和纵向组装成纤维，浊度增加较快。反之，初始胶原质量浓度过低，微纤维少，浊度增加缓慢，停滞期延长。因此选择胶原初始质量浓度2 g/L作为优化条件。

2.1.2 pH值对转化率的影响图2显示了pH对胶原溶液自组装转化率的影响。由图2A可见，pH过低(6.5，7.0)或过高(8，8.5)均影响自组装转化率。当pH=7.5时，自组装转化率最高。从图2B可知，在pH值较低时，形成凝胶的速度较为缓慢；当pH较高时，形成凝胶的速度较快，但对应的转化率却有所下降。这一现象和胶原自身等电点pI有关，当pH ＜ pI时，胶原分子表面的正电荷较多，胶原容易解离；而当pH ＞ pI时，胶原聚集体之间的排斥作用增加，当排斥力大于维持胶原稳定的作用力时，胶原分子间聚集减弱，即导致转化率的降低。因此选择pH=7.5作为优化条件。

2.1.3磷酸盐终浓度对转化率的影响 磷酸盐终浓度对组装转化率的影响见图3所示。磷酸盐终浓度过低或者过高均影响胶原溶液的自组装，磷酸盐终浓度15-20 mmol/L时转化率最高。磷酸盐终浓度过高，停滞期较长，胶原聚集体之间的排斥作用增大，胶原聚集受阻；终浓度过低，停滞期较短，盐离子对浊度的阻滞作用较小，胶原分子表面的静电作用较大，分子间可通过静电作用聚集。因此实验选取的磷酸盐终浓度为20 mmol/L。

2.1.4组装条件的优化 正交实验因子及水平、直观分析结果及方差分析见表2，3。表2显示在胶原溶液初始质量浓度、pH、磷酸盐终浓度3个因素中，磷酸盐终浓度对组装转化率的影响最大，pH对转化率影响最小，最佳因素水平为A2B3C1，即初始质量浓度2 g/L，pH为8，磷酸盐终浓度为15 mmol/L。由表3可知，C因素对转化率影响显著，与极差分析一致，因此选用最佳工艺组合A2B3C1。

为了验证正交实验结果的可靠性，在最佳工艺下进行3次验证实验，所得转化率均值(96.58%)与表2中6号的转化率(97.80%)相差不大。因此，在后续实验中选用A2B3C1此最优工艺制备组装胶原液，经过冷冻干燥得到纤维化胶原蛋白海绵。

图1 胶原溶液初始质量浓度对胶原蛋白体外自组装转化率的影响及对应的浊度曲线Figure 1 Effect of initial collagen concentration on conversion yields and the corresponding turbidity curves图注：图中A为转化率，B为浊度曲线。

图2 pH对胶原蛋白体外自组装转化率的影响及其对应的浊度曲线Figure 2 Effect of pH on conversion yields and the corresponding turbidity curves图注：图中A为转化率，B为浊度曲线。

图3 磷酸盐终浓度对胶原蛋白体外自组装转化率的影响及对应的浊度曲线Figure 3 Effect of final phosphate buffer concentrations on conversion yields and the corresponding turbidity curves图注：图中A为转化率，B为浊度曲线。

2.1.5自组装胶原液的红外表征 自组装胶原蛋白的红外图谱见图4所示。3 305 cm-1处主要为酰胺A带的N-H或O-H的伸缩振动，3 073 cm-1处的弱吸收为酰胺B带的C-N伸缩振动峰。1 640 cm-1处为酰胺Ⅰ带的C=O伸缩振动，1 550 cm-1处为酰胺Ⅱ带的吸收峰，由N-H弯曲振动和C-N伸缩振动耦合产生。1 454 cm-1处为-CH的弯曲振动吸收峰，1 238 cm-1处为酰胺Ⅲ带的C-N伸缩振动、N-H弯曲振动以及脯氨酸和肽链骨架上的CH2的摇摆振动[29-31]。酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带的吸收峰是蛋白质在红外图谱中的特征吸收峰，可直接反映蛋白多肽链的构象。

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