纤维化胶原蛋白海绵的制备及其自组装工艺(2)
胶原蛋白分子在体内可组装成有序的纤维结构,赋予了胶原蛋白更高的耐降解性能和机械强度[16-22],这种胶原分子的自组装同样可以在体外得到模拟[23-27]。据此,实验针对已有的技术缺陷,提供了一种新的交联改性方法——离子键交联改性法,既避免了细胞毒性反应又能保持胶原的生物学性能。由改性后的胶原制备得到的支架材料同样应当具备良好的力学性能和耐降解性能。
实验将胶原蛋白体外自组装成胶原纤维,并以自组装转化率为指标对组装工艺进行了优化,通过冷冻干燥技术制备了纤维化胶原蛋白海绵,并对组装前后胶原蛋白海绵的微观结构及物理化学性质进行了比较。
1 材料和方法 Materials and methods
设计:工艺研究。
时间及地点:于2013年3月至2014年10月在江南大学药学院、无锡贝迪生物工程有限公司完成。
材料:胶原蛋白(Mw≥30 000,纯度> 98%)由无锡市贝迪生物工程有限公司提供。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、冰醋酸、氯化钠等购于国药集团化学试剂有限公司。Ⅰ型胶原酶(125 U/mg)购于Sigma试剂有限公司。
实验方法:
胶原蛋白自组装工艺:
制备方法:4℃条件下将3 g/L胶原乙酸溶液与PBS(pH=7.4)以4∶1体积混匀,用0.1 mol/L NaOH溶液调节混合液的pH至7.5,混匀,使胶原蛋白终质量浓度为2.14 g/L,磷酸盐终浓度为20 mmol/L。将混合液转移到35℃鼓风干燥箱中,使其充分自组装,24 h后离心去上清,透析除盐,得到自组装的胶原蛋白溶液。
单因素分析:分别考察不同的胶原溶液初始浓度(0.5,1,2,3,4 g/L);混合液pH(6.5,7,7.5,8,8.5);磷酸盐终浓度(5,10,15,20,25 mmol/L)对胶原蛋白自组装转化率的影响。
正交实验优化:根据单因素实验结果,选择胶原溶液初始浓度(A)、pH值(B)、磷酸盐终浓度(C)为实验因子,以自组装转化率为指标,进行L9(34)正交实验,考察这些因素的协同作用,以得到最优胶原蛋白自组装工艺条件。上述3个因素各取3个水平,其实验设计见表1。
表1 正交实验因子水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design水平 A(胶原溶液初始质量浓度) B (pH值) C(磷酸盐终浓度) 1 1 g/L 7 15 mmol/L 2 2 g/L 7.5 20 mmol/L 3 3 g/L 8 25 mmol/L
自组装转化率[28]:将胶原分子转化成微纤维的量,通过离心后上清液中胶原蛋白的含量来测定,上清液中胶原蛋白的含量通过羟脯氨酸含量来定量。
具体方法:取离心上清液1 mL,加入等体积6 mol/L浓盐酸溶液,氮气保护,105℃水解24 h,冷却,将水解产物转移至50 mL容量瓶中,定容。取稀释液1 mL于试管中,加入氯胺T试剂,混匀后静置20 min,随后加入1 mL过氯酸,静置5 min后加入1 mL显色剂对二甲氨基苯甲醛,混合后,置于60℃水浴中,加热20 min,冷却至室温后于560 nm测吸光度值,以羟脯氨酸标准曲线为标准,计算羟脯氨酸含量。误差棒由3组平行样品计算标准偏差所得。
浊度测试:胶原分子在自组装过程中逐渐形成微纤维,使得溶液浊度升高,进一步形成凝胶,因此胶原蛋白自组装的动力学可通过溶液中浊度的变化来监控。将4℃条件下混匀的胶原乙酸溶液与PBS混合液迅速转移至35℃水浴中,在400 nm下测定混合液的浊度随着孵育时间的变化情况。
自组装胶原液的红外表征:将自组装胶原蛋白溶液冻干后,采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪在4 000-400 cm-1范围内进行扫描测定[29],并记录图谱。
胶原蛋白、改性胶原蛋白海绵的制备:取相同浓度胶原蛋白溶液和最优组装条件所得的组装胶原蛋白溶液,铺板于孔板中,冷冻干燥得海绵支架材料,分别标记为Col、FCol。
胶原海绵的表征及性能测试:
扫描电镜表征:胶原蛋白材料的微观结构和表面形貌通过S-4800场发射扫描电子显微镜观察。将材料置于铜板上,喷金后,观察海绵的微观结构和表面形貌。加速电压为1 kV。
机械性能:将支架材料剪成条状,室温下,用SLBI-500N型拉力试验机进行拉伸强度测试,拉伸速率为1 mm/min。
溶胀性能:将精确称质量(m0)的支架材料浸泡于PBS(pH=7.4)中,浸泡5 h后取出支架材料,用滤纸小心吸取表面溶液,称质量(mt)。支架材料的溶胀率(Swelling Ratio SR)计算公式如下:
SR=(mt-m0)/m0
保水率:支架材料的保水率参照文献方法测定[13]。具体方法如下:将在PBS中充分溶胀的支架材料取出,称重(ms),然后放入含有滤网的离心管中,500 r/min离心3 min,取出称质量(m),材料的保水率为:
文章来源:《机械强度》 网址: http://www.jxqdzzs.cn/qikandaodu/2021/0503/692.html